血流感染(BSI)是危及人類生命健康的全身性感染疾病,可導(dǎo)致菌血癥、敗血癥和膿毒癥,嚴(yán)重者可引起休克、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、多臟器功能衰竭乃至死亡。以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌(KP)為代表的革蘭陰性菌是血流感染的主要病原體,在中國由大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌引起的血流感染超過50%。
隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌(CRE)流行與耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻。碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)是CRE血流感染的主要致病菌,長期處于高水平流行狀態(tài),耐藥性日趨嚴(yán)重,并伴有較高的病死率。在中國CRKP在CRE分離株中的占比為60%~90%,由于多重耐藥菌株的快速傳播、高死亡率以及缺乏有效的抗菌藥物,CRKP所致BSI在臨床治療方面極具挑戰(zhàn)。
當(dāng)前對(duì)CRKP的鑒定主要采用傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn),但非常耗時(shí),需要數(shù)天甚至數(shù)周,容易延誤臨床治療的時(shí)機(jī),因此,探索一種快速檢測(cè)CRKP的新方法具有重要的臨床意義。
研究成果
近日,南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科胡龍華教授團(tuán)隊(duì)基于氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用(GC-IMS)技術(shù),通過測(cè)定CRKP和碳青霉烯類抗生素敏感的肺炎克雷伯菌(CSKP)在血培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的代謝性揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)的特異性改變,實(shí)現(xiàn)了對(duì)CRKP的快速鑒定,其研究成果發(fā)表在應(yīng)用微生物領(lǐng)域?qū)I(yè)期刊AMB Express上(圖 1),為臨床微生物快速鑒定和藥敏試驗(yàn)提供了一個(gè)新思路。
圖 1 論文《GC-IMS技術(shù)助力在模擬血培養(yǎng)中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的鑒定》
胡龍華教授團(tuán)隊(duì)基于KP的4種標(biāo)準(zhǔn)菌株和69株臨床分離株展開研究,使用相同的血培養(yǎng)條件,所有菌株產(chǎn)生的VOCs分別在氣相色譜離子遷移譜聯(lián)用儀(FlavourSpec®)上檢測(cè),為了觀察亞胺培南(IPM,一種碳青霉烯類抗生素,具有超廣譜、高效能的抗菌活性,對(duì)多種病原體所導(dǎo)致的中重度混合感染有明顯的抗菌作用)對(duì)CSKP和CRKP的作用,標(biāo)準(zhǔn)菌株在血培養(yǎng)3h后分別加入終濃度為0.25mg/mL的IPM,并設(shè)置4個(gè)連續(xù)的時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)菌液進(jìn)行VOCs的檢測(cè)。同時(shí)為了探索鑒定產(chǎn)碳青霉烯酶(CBPM)的KP,對(duì)CRKP各亞型加入CBPM抑制劑進(jìn)行研究。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)流程圖詳見圖 2:
圖 2 實(shí)驗(yàn)研究流程圖
經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)和檢測(cè),總共檢測(cè)出54種VOCs(其中6種VOCs同時(shí)檢測(cè)到單體和二聚體),包括4種有機(jī)酸、3種醇、3種酯、4種酮、2種吡嗪、2種苯衍生物和30種未定性VOCs。可定性VOCs詳見表 1,同時(shí)發(fā)現(xiàn)KP在培養(yǎng)5h后達(dá)到指數(shù)生長期的終點(diǎn),后續(xù)時(shí)間點(diǎn)其VOCs的變化不明顯,因此相應(yīng)的研究實(shí)驗(yàn)均在5h(T2)時(shí)間點(diǎn)開展。
表 1 KP血培養(yǎng)種檢測(cè)到的可定性VOCs
在CRKP和CSKP的鑒定中,在不添加IPM的條件下,通過檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的VOCs,發(fā)現(xiàn)5種VOCs在兩個(gè)組別種存在顯著性差異,相對(duì)于CSKP,CRKP的未定性物質(zhì)3#、21#、28#和正丁醇含量增加,而未定性物質(zhì)30#含量減少(圖 3)。之后主成分分析顯示上述5種VOCs可有效地區(qū)分CSKP和CRKP(圖 4),但這一差異會(huì)隨著時(shí)間推移而消失。
圖 3 檢測(cè)到的5種VOCs在CSKP和CRKP組間的含量差異
(ATCC BAA-1706為CSKP標(biāo)準(zhǔn)菌株,ATCC BAA-1705/2146/2524為CRKP標(biāo)準(zhǔn)菌株)
為了進(jìn)一步探究IPM對(duì)KP的生長代謝以及釋放的VOCs的影響,在標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)3h(T0時(shí)間點(diǎn))后,加入終濃度0.25mg/mL的IPM,并在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的VOCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRKP組的VOCs和未加入IPM前保持了相同的變化趨勢(shì),而CSKP組的VOCs變化較為明顯,相對(duì)于CSKP組,CRKP組的3-甲基丁酸(單體、二聚體)、2-甲基丙烯酸(單體、二聚體)、乙酸、丁二酮和3-羥基-2-丁酮的含量顯著升高,而苯甲醛二聚體和丁酮的含量顯著降低。同時(shí)在未定性的物質(zhì)中,11種VOCs存在上升的趨勢(shì),而2種VOCs存在下降的趨勢(shì)(圖 5)。
圖 4 CSKP和CRKP的PCA圖(未加入IPM) 圖 5 CRKP組VOCs相對(duì)于CSKP組的變化(加入IPM后)
在CRKP中,最為常見的是產(chǎn)CBPM的KP,為研究VOCs的檢測(cè)是否有助于鑒定產(chǎn)CBPM的CRKP,在標(biāo)準(zhǔn)菌株中加入IPM的同時(shí),分別設(shè)置加入/不加入CBPM抑制劑進(jìn)行對(duì)照研究,并在后續(xù)的時(shí)間點(diǎn)觀察VOCs的變化情況。以產(chǎn)A類碳青霉烯酶KP為例,結(jié)果表明,ATCC BAA-1705菌株在加入CBPM抑制劑后,和未加入CBPM抑制劑相比,出現(xiàn)了5種VOCs(苯甲醛二聚體、2,5-二甲基吡嗪二聚體、2-甲基吡嗪二聚體、丁酮和未定性VOCs15#)含量的上升以及13種VOCs(2-甲基丙烯酸單體和二聚體、丙酸單體和二聚體、乙酸、3-羥基-2-丁酮和7種未定性物質(zhì))含量的下降(圖 6)。通過PCA分析顯示CBPM抑制劑的加入可鑒定ATCC BAA-1705為A類產(chǎn)CBPM的CRKP(圖 7)。與之相似的是,加入CBMP抑制劑后,產(chǎn)B類碳青霉烯酶KP(ATCC BAA-2146)的VOCs發(fā)生了特異性改變。
圖 6 ATCC BAA-1705菌株加入CBPM抑制劑后的VOCs變化 圖 7 加入CBPM抑制劑后的標(biāo)準(zhǔn)菌株VOCs的PCA圖
針對(duì)臨床分離的菌株,也先后通過加入IPM進(jìn)行了CRKP的研究,以及加入CBPM抑制劑進(jìn)行對(duì)產(chǎn)CBPM的CRKP的鑒定探索。本次研究涉及69例臨床分離株,其中25例CSKP和44例CRKP,在44例CRKP中,包含20例KPC陽性株、15例NDM陽性株、4例IPM陽性株和5例CBPM陰性株。
加入IPM后,相對(duì)于CSKP,各亞型的CRKP均出現(xiàn)了部分VOCs的顯著性變化(表 2,圖 8)。結(jié)果表明IPM的加入可有效地鑒定產(chǎn)CBPM的CRKP,包括KPC陽性菌株、NDM陽性菌株和IPM陽性菌株。
表 2 CRKP臨床分離株加入IPM后相對(duì)于CSKP的VOCs變化
圖 8 加入IPM后各亞型CRKP產(chǎn)生的VOCs的變化(相對(duì)于CSKP)
針對(duì)臨床分離株,通過VOCs的檢測(cè)鑒定產(chǎn)CBPM的CRKP,同標(biāo)準(zhǔn)菌株同樣的實(shí)驗(yàn)操作方法,以加入B類酶抑制劑(DPA)為例,在T2時(shí)間點(diǎn)對(duì)VOCs進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在加入DPA后,部分VOCs出現(xiàn)了顯著的變化,包括KPC陽性株出現(xiàn)了4種VOC的升高和8種VOCs的降低;NDM陽性株出現(xiàn)了8種VOCs的升高和11種VOCs的降低;相比于NDM陽性株,IPM陽性株出現(xiàn)了1,2-乙二醇的升高和3-羥基-2-丁酮以及4種未定性VOCs的降低(圖 9)。
圖 9 臨床分離株加入IPM和CBPM抑制劑后的VOCs的變化情況
綜上所述,本研究得到以下的結(jié)果:①通過血培養(yǎng)瓶中VOCs的相對(duì)組分檢測(cè),可實(shí)現(xiàn)對(duì)KP的鑒定。②在加入IPM后,CSKP和CRKP釋放的VOCs的差異得到了進(jìn)一步證實(shí),從而發(fā)現(xiàn)了識(shí)別和鑒定CRKP的潛在VOCs指標(biāo)。③CBPM抑制劑的加入使相應(yīng)菌株中特異性VOCs的組成發(fā)生了明顯的變化,從而為CBPM表型的檢測(cè)提供了一種新的方法,為臨床引起BSI常見的KP的鑒定和耐藥性評(píng)估開辟一種快速的新方法。針對(duì)上述的研究結(jié)果,后續(xù)有待于進(jìn)一步深化研究,開展更大規(guī)模的臨床多中心驗(yàn)證以及前瞻性研究。
關(guān)于GC-IMS技術(shù)
氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用(GC-IMS)技術(shù)是將氣相色譜的高效分離與離子遷移譜的痕量快速分析優(yōu)勢(shì)相結(jié)合,經(jīng)過二次分離后得到保留時(shí)間、漂移時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度的三維譜圖,實(shí)現(xiàn)對(duì)各類樣品中VOCs的痕量檢測(cè),目前廣泛應(yīng)用于風(fēng)味、泛環(huán)境和醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的研究。設(shè)備具有高靈敏度、適應(yīng)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速分析的特點(diǎn),相關(guān)的檢測(cè)流程示意圖詳見圖 10,本研究對(duì)于KP產(chǎn)生的VOCs的檢測(cè)操作均在氣相色譜離子遷移譜聯(lián)用儀(FlavourSpec®)上完成。
圖 10 GC-IMS檢測(cè)原理流程示意圖